武漢核成科技發展有限公司—顯微成像、分子成像、活體成像
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如何選購顯微成像攝像系統?
點擊次數: 發布時間:【2018-04-08】

    如今,圖像處理技術在大范圍的光學顯微應用中使用,其中包括醫學和生物學研究、診斷、醫療產品測試或材料科學。 有了顯微鏡,即可直接訪問并研究最多樣化的對象的結構和功能。然而,僅使用一個方法,基本上不太可能得到所需的所有信息。 因此,提供眾多顯示方案和分辨率的許多不同顯微技術漸漸得到了發展。 該白皮書說明了選擇相機時要考慮的各個方面。

  要在顯微鏡中使用圖像處理,選擇最適合顯微應用的組件至關重要。除了顯微鏡本身,還需要選擇合適的鏡頭、光源,以及——取決于是否使用染料和比對方法,還需要濾光片組和偏振鏡。最終,相應應用的特殊要求決定了如何選擇最適合的顯微相機和兼容的圖像處理軟件。

  數字顯微相機以最優的使用圖像數據的方式提供顯微圖像。該圖像數據可被記錄、存儲、打印或嵌入文檔;然后使用特殊的軟件,在PC 或移動設備上以數字方式處理和分析由顯微相機提供的這些圖像數據。數字顯微相機提供的圖像可以快速地顯示在大屏幕顯示器上,因此方便用于現場演示或觀察等目的。

  不過,如何為顯微應用尋找合適的數字相機,在做選擇時必須考慮哪些方面?

  1. 黑白相機還是彩色相機?

  彩色相機在其應用中是非常靈活的,是傳統光學顯微鏡廣泛應用領域中不可分割的一部分。生物醫學和臨床實驗室裝置以及工業和材料研究中的許多常規微觀應用是基于使用各種光源和比對方法的傳統光學顯微鏡。此外,顯微標本通常使用特殊的染色技術,以便詳細分析原本對比度較低的結構,例如作為疾病組織病理學診斷的組成部分和監測疾病發展。

  因此,對于顯微成像,色彩保真度和色彩重現應該盡可能準確,以便材料和生物樣本中最細小的結構區別可以重現。

  顯微相機中的數字彩色芯片使用與感光芯片匹配的不同顏色的濾光片記錄色彩信息。

  黑白芯片(左)和芯片上帶Bayer濾光片形式的彩色濾光片的芯片(右)。 通常,彩色芯片會使用較小但較多的像素來實現同等“真實”的分辨率。 黑色區域代表重現中的一個點。

  通常,彩色芯片的每個像素只記錄一種顏色,但通常圖像上每個像素都包含所有顏色。為了達到這個目標,每個像素都會使用相鄰像素的信息。要給每個芯片像素分配完整的顏色信息,必須對每個三原色以插值填充缺口(“去拜耳化”)。去拜耳化可能導致插值效應,并且彩色濾光片會降低光吸收效率,特別是在光照條件不佳的情況下。

  然而,得益于靈敏度相當高的彩色相機,可以使用較低的光強度實現大量的應用,例如在標準熒光顯微鏡中。彩色相機可以工作在明場與暗場中,非常適合顯微鏡,可以在比對程序和熒光應用中選用。它們也適合使用多波段濾光片同步監控和記錄一些熒光體。

  腎臟組織的光顯微圖像:為區分不同的細胞和組織結構,對組織學組織部分使用蘇木精和曙紅進行了染色(HE染色)。

  黑白相機提供成像芯片上的亮度值的完整信息,雖然沒有顏色信息。即使沒有進一步的計算,此處每個像素的信息也都是可用的。黑白相機沒有彩色相機由于通過彩色濾光片吸收光能而損失強度的問題。然而,黑白芯片通常在芯片前面有一個二維紅外截止濾光片,抵消了光源發射的紅外光。在許多應用中,發出的這些紅外光不會對圖像信息作出貢獻,只會降低圖像的對比度。

  因此,如果不需要顏色信息,可能會提高靈敏度和加強信息內容。因此,黑白相機非常適合應用在復雜的熒光顯微鏡中。曝光時間可能會減少,因此敏感的熒光樣品的應用效果相當好。即使在弱光信號中,對光線更敏感的芯片也可以呈現低噪聲圖像。特殊的NIR芯片版本增強了包括近紅外范圍在內的敏感性。

  活的人類黑色素瘤細胞的熒光顯微圖像:熒光染色后,某些細胞質元素呈現綠色,而細胞核呈現藍色熒光。

  2. 感光芯片類型(CCD與CMOS)、快門選擇、幀速率

  下一個重要步驟是選擇最合適的芯片。從技術的角度來看,需要在CMOS與CCD芯片之間作出選擇。接下來需要選擇最好的幀速率,即:無縫處理任務,相機每秒必須提交的圖像數量。

  感光芯片類型

  市場上有大量適合作為顯微相機成像芯片的基于CCD(電荷耦合器件)和基于CMOS(互補金屬氧化物半導體)的芯片。這些芯片類型的技術設計完全不同,因此它們的特征屬性也不同。如何選擇正確的芯片類型取決于應用。

  CCD和CMOS芯片將光信號(光子)轉換成電信號。值得注意的是它們不同的特征以及這些特征將如何隨進一步的技術開發而改變。

  CCD感光芯片有哪些顯著特點?一般來說,CCD芯片具有低噪聲因子、高填充因子、高信噪比、高顏色保真度的成像特點,可輸出超高品質圖像。這些屬性使得使用CCD芯片的相機成為弱光條件下應用不錯的選擇。

  今天的CMOS芯片有時比一些普通CCD芯片更優秀。

  近年來,得益于根本性的新發展,它們趕上了CCD芯片。憑借高速(幀速率)、高分辨率(像素數)、低功耗以及新改良的噪聲指數、動態范圍、量子效率及色彩概念等各方面優勢,CMOS芯片逐漸在由CCD芯片統治的領域里取得了一席之地。這一點同樣適用于顯微鏡(特別是高速顯微鏡),而新色彩概念的現代CMOS芯片能提供優秀的實時成像。

  CMOS面陣感光芯片

  鑒于CMOS技術近年來所取得的長足進步,可以預期其在未來也一定會有更多突破性的新進展。市場趨勢表明,最新的CMOS技術將一定程度地取代CCD技術。

  幀速率

  這個專業術語的含義為“每秒多少幀圖像”或“fps”。這些術語描述芯片可在每秒鐘拍攝與傳輸的圖像數量。

  幀速率越高,芯片的速度則越快,也就是說每秒能夠拍攝更多圖像,并且傳輸更高的數據量。可能或必要的幀速率取決于隨相機使用的顯微系統類型和顯微鏡中的相機需要記錄的內容。

  對于許多系統,直接查看監控上的無延遲實時成像是主要目標,這可以實現對樣品的無縫篩查與快速聚焦。人類的大腦每秒能檢測約14到16幅畫面,而訓練有素的人可以顯著提高這個數字。標準影院電影的幀速率為24 fps,最近的出品甚至達到48 fps。理想情況下,標準顯微相機的幀速率是在這一范圍內。

  然而,確定實時監控舒適度的不僅是移動圖像的平滑播放,而且還有良好的成像質量和清晰度。這里逐行掃描技術提供了一個決定性的優勢。

  對于除了要求高成像質量還要求高吞吐量的自動化應用,顯著提高幀速率非常重要——例如,在樣品范圍的自動掃描中,要求自動聚焦或在盡可能最短的時間內用多張圖像重現整個樣品。

  快門

  與芯片選擇相聯系的是快門系統的選擇。

  全局快門以及滾動快門是兩個主要的快門選項。快門能夠保護相機內部的芯片不受入射光線的影響,且只有在曝光時才會打開。所選的快門或曝光時間將會確保像素接收適當數量的光子,并決定快門維持打開狀態的時間。CCD芯片只使用全局快門,而CMOS芯片則提供全局快門與滾動快門兩種版本型號。

  兩個版本快門的差別在于芯片曝光圖像的方式:

  全局快門是整個芯片同時曝光,也就是說光線將同時照射到芯片的整個表面。

  而滾動快門是在很短的時間序列中(數微秒內)逐格漸次曝光。取決于所選取的曝光時間以及目標的實際速度,目標在曝光過程中移動可能會導致圖像失真。這被稱為滾動快門效應。

  顯微鏡應用中的某些情況(例如在樣品/試樣臺高速運動的情況下或高動態過程的觀察中)不希望發生這一效應。然而,帶滾動快門的芯片非常適合大多數標準應用,它們提供了一些勝過全局快門的優勢。得益于低讀出噪聲,其動態范圍明顯更高,給人印象深刻。高動態范圍允許實現極高品質的記錄以及對詳細結構信息的分析。

  此外,通過使用特定范圍內的曝光時間,能夠防止滾動快門效應。一些用于科學應用的基于CMOS的高性能相機即工作在滾動快門模式下。

  3. 分辨率、感光芯片與像素尺寸

  在數字圖像處理中,因數字圖像能夠以不同大小打印或重現于不同尺寸的顯示器上,傳統顯微鏡中作為鏡頭和目鏡放大倍數計算結果的專業術語“放大倍數”失去了其原有的意義。但是,主要由鏡頭的數值孔徑(NA)確定的鏡頭光學分辨率仍很重要。

  相機拍攝的同一幅圖像,以不同像素數顯示

  分辨率

  在顯微鏡中,專業術語“分辨率”指的是兩個高對比度對象可以在顯微鏡下被識別為圖像中兩個單獨的對象而不會被合并為一個對象的最小距離(dmin)。

  對于最佳光源條件下的常規光學顯微鏡,分辨率是由所用光的波長λ(計算時通常使用550 nm)以及由所用顯微鏡鏡頭的數值孔徑NA決定的。

  適用Rayleigh準則:dmin = 0.61·λ/NA。

  專業術語“分辨率”也用于描述數字相機的芯片。它經常被用于指示芯片上的像素數量。例如,相機的分辨率可以是800萬像素,這意味著光學配件投影到芯片上的成像隨后被分解成芯片上的800萬個像素。應用這一術語,指定芯片使用100萬像素與3200萬像素之間的“分辨率”。

  不過,指定像素分辨率更有意義。如果沿相機像素的邊長向后經過光學配件跟蹤到對象,像素的分辨率顯示理想情況下一個相機像素應該涵蓋的對象上相應的距離長度。

  對于顯微相機,顯微鏡中所使用的任何鏡頭的像素分辨率應該高于鏡頭的光學分辨率。事實上,我們推薦使用像素分辨率至少是光學分辨率三倍的鏡頭。

  對顯微鏡鏡頭來說,數值孔徑范圍在0.1(通常針對4倍放大的鏡頭)和1.3(通常針對100倍放大的鏡頭)之間(對應于3.4 m到0.26 m的光學分辨率),在這個范圍內最小的光學解析結構可提供足夠數量的像素。

  例如,如果需要更低的放大倍數,則需要一臺達到相應高分辨率的相機,以便對顯微圖像的細節進行最佳記錄和重現。此時,超過500萬像素的分辨率可能確實有用。但是,對于大的放大倍數,由于光學系統的限制,這樣的高分辨率通常無法提供任何額外的圖像信息。取決于應用,300萬到500萬像素通常就足夠了。

  像素大小也很重要。如果像素非常小,光學配件可解析的最小結構會受到一定的限制。合理的選擇是像素寬度5 m或以上的黑白芯片以及像素邊長大于等于2.5 m的彩色芯片。

  感光芯片尺寸和視場(FOV)

  越大就一定越好嗎?較大尺寸的芯片的優勢是較大的表面可容納較多的像素,因而提供較高的分辨率。其實大型芯片的真正優勢在于單個像素的尺寸仍足以確保能夠取得較好的信噪比——較小的芯片所能夠使用的空間不多,因此需要使用尺寸較小的像素(另請參閱“像素大小和靈敏度”一節)。

  然而,實際上需要多大的芯片呢?在這里,除了所需的像素大小和像素數目外,能否最優化重現視場起到了重要作用。

  使用顯微鏡時,通過兩個步驟創建圖像:顯微鏡的鏡頭創建(必要時連同顯微鏡中的鏡筒鏡頭)中間圖像。用戶通過目鏡查看此中間圖像。總放大倍數由鏡頭的放大倍數和目鏡的放大倍數決定。由于物理和技術的限制,鏡頭只能在有限區域創建具有完整圖像清晰度的中間圖像。圓形鏡頭圖像的直徑(如果適用)則稱為鏡頭的視場寬度。

  鏡頭的圖像由目鏡再次放大。區域的最大直徑(目鏡仍然可以清楚地放大的范圍)稱為目鏡的視場。目鏡視場和鏡頭的視場直徑應該相匹配,達到“模擬”顯微鏡的最佳重現效果。目鏡的視場(視場數)表示特定顯微鏡鏡頭的視場大小。目鏡常用的視場數是18、20 或22mm等等。然而,在實踐中超過23或25mm的視場直徑也是常見的。

  通過使用匹配的三目鏡筒(主要使用C口連接)或目鏡固定器使顯微相機適合顯微鏡,可以繞過目鏡的光學配件,直接通過相機查看鏡頭的中間圖像。

  因此,鏡頭的視場直徑是顯微相機的決定性值,因為通過顯微鏡鏡頭創建的圖像會被直接復制到顯微相機的芯片。因此,顯微相機的芯片大小與視場直徑應實現最優匹配。一方面要將圓視場的最大部分重現到有棱角的芯片上,另一方面還要防止最接近視場邊緣的地方出現重現錯誤。這意味著,芯片的圖像對角線應該比鏡頭視場直徑略小一些,以便芯片圖像的所有區域都能以最佳清晰度重現。

  市場上芯片的圖像對角線不一而足。上圖顯示了最常見的芯片大小。以英寸表示芯片大小是因為歷史原因確定的,它遵循反映早期的圖像記錄管的直徑的約定。遵循此約定,一英寸不等于25.4mm, 而是大約16mm。

  對于許多標準的顯微鏡光學配件,大小為2/3"的CCD、CMOS芯片在放大倍數、分辨率和顯微鏡視場中圖像部分的大小之間提供了理想的折中方案。

  如果選擇了一個過小或過大的芯片,需要使用集成在中間光學配件中的適配器將鏡頭視場與芯片匹配(也就是進行相應的縮小或后放大)。

  如何調整感光芯片尺寸和視場

  使用帶有集成中間光學配件的C接圈優化和調整芯片尺寸和視場:

  鏡頭放大倍數10x 目鏡放大倍數10x 目鏡18的視場數

  芯片尺寸1/2"(內部圖像部分)和4/3"(外部圖像部分)

  1/2" 芯片傳送的可見中間圖像的百分比是沒有進行適應的圖像的約12%(內部圖像部分)。此圖像部分(中間圖像部分)可能相應使用帶有集成縮小光學配件(0.65x或本案例的0.5x)的C接圈進行優化。 如果芯片明顯大于1"(外部圖像部分)并超出視場的邊緣,可能會使用帶有集成放大光學配件的相應適配器(例如1.2x 或1.6x)調整到該視場。

  最常見且最適合顯微應用的是縱橫比為4:3的芯片。縱橫比為1:1的芯片可以重現鏡頭的直觀可見中間圖像的最大部分。也可以使用3:2 或16:9等其他芯片格式,但在像素數相同的情況下,因為它們的圖像高度低于4:3芯片,所以重現的視場部分較小。

  HD(高清)或全高清格式(目前已經全面作為電影和電視的標準)盡管現在對于顯微鏡而言仍然有些爭議,但它們完全適合(比如說) 將現場圖像投放到大型顯示器上以用于討論。通過將視頻技術和數字圖像處理技術相結合,可以方便地查看、研究和分析快速變化過程。

  像素大小和靈敏度: 正如前面討論的那樣,像素數或更確切地說是圖像芯片分辨率對顯微圖像的信息內容和質量起著關鍵的作用。盡可能提高分辨率這一總體趨勢顯而易見,但是分辨率增加也意味著像素減小。一般來說,較大像素的靈敏度高于較小的像素。最終需要具體為每個應用選擇圖像噪聲、信噪比(SNR)、飽和容量和相關的動態范圍的最佳組合。

  圖像噪聲:各種噪聲的影響(例如暗噪聲、光子噪聲或數字化噪聲)可能與信號疊加,從而對數字圖像產生負面影響。在高靈敏度芯片中,如果在弱光條件下測量信號非常弱,那么圖像噪聲就會尤其顯著。這里的檢出限主要由暗噪聲決定,暗噪聲是熱效應(也就是芯片發熱)所引起的。可以通過被動或主動對芯片進行冷卻大大減少這種熱效應,例如利用氣流、水或半導體元素(另請參閱“制冷芯片與非制冷芯片”一節)進行冷卻。

  飽和容量:飽和容量(也稱為滿井容量)描述一個單獨的像素能夠吸收電子的最大數目。光照射芯片生成電子。

  信噪比:大像素比小像素的飽和容量更高。這意味著它們對光在像素中產生的電子有更大的容量。反過來,這意味著它們能夠處理更多的光。

  高飽和容量意味著信噪比更好,也就是說像素面越大,信噪比(SNR) 越好。信噪比表示相機數據屬于實際圖像內容的部分與不需要的噪聲信號的差值因子。信噪比SNR越高,成像質量越好。

  簡而言之:如果給定芯片大小,相機芯片的像素越多越不利于信噪比(也就是說信噪比較小)。

  動態范圍:定義了芯片對光的響應的下限和上限之后,我們最后可以解釋漏掉的這個專業術語“動態范圍”(DR):它定義為飽和容量(滿井容量)與檢出限的比率。用另一種方式說明:動態范圍是像素作為對入射光的真實響應而能夠檢測到的最亮值和最暗值的比例。如果您的應用需要高動態范圍,則推薦使用像素相對較大的芯片。

  如今,大小在3.5u m和6 um之間的像素提供了以前10 m像素所能提供的輸出:在感光度和高分辨率之間實現了良好平衡。像素大小從2.2 um到不到1.4u m的芯片具有高分辨率且價格實惠。它們能提供高分辨率,但因為面積小,所以感光度較低。

  對于熒光顯微鏡等弱光條件應用,芯片的靈敏度尤其重要。在這種不利的光源條件下,相機需要有好的信噪比,以確保仍能檢測到非常低的光信號,同時又有良好的成像質量。

  4. 顯微鏡應用中制冷CCD/CMOS感光芯片與非制冷CCD/CMOS感光芯片

  所有芯片都會生成所謂暗噪聲或暗電流。熱會在感光芯片上的像素中生成電子,與光所生成的電子相混合,從而產生干擾,覆蓋所需的圖像信息,并扭曲圖像內容。此外,非制冷芯片的暗電流和噪聲會有變化,具體取決于芯片的溫度。因芯片在操作過程中會逐漸升溫,這會導致與環境和操作溫度相關的波動。在長期暴露的情況下,芯片的電壓和溫度也會升高,它反過來會被解釋為像素和感知為噪聲。

  通過制冷芯片可以減少暗電流。假設圖像信號保持不變,將芯片的溫度與環境溫度相比降低7攝氏度,暗電流約降低一半。

  在這里新的芯片技術具有明顯的優勢,這包括新一代的CMOS芯片。得益于較低的功耗和優化的電子元件,這些芯片可顯著改進噪聲性能。

  帶非制冷芯片的數字相機完全適用于許多標準顯微鏡應用,可提供出色的成像質量,并滿足所有的圖像處理和分析要求。

  但特別是,如果需要在不利光源條件下長時間曝光,或者需要特別恒定、重現性好的結果進行圖像分析或作進一步處理,制冷芯片是正確選擇。例如,在現代熒光顯微鏡中的復雜應用、在活的有機體內的生物發光應用或在天文學中,這種要求占主流。

  5. 接口

  一般來說,相機用戶通常可以在幾個接口之間加以選擇。最重要的適用接口是USB 2.0、USB 3.0、1394 (FireWire)、千兆網(GigE)或Camera Link。

  作為眾多應用的新的簡單標準,USB 3.0越來越突出。USB 3.0也被稱為Super Speed USB,是流行的新一代“即插即用”通用串行總線規范,它以USB 2.0的優勢為基礎,同時也糾正了其弱點。目前USB 3.0已經成為無需額外硬件的標準PC接口。在不久的將來,USB 3.0將取代可用接口范圍中的1394 (FireWire)和2.0。某些操作系統已不再將1394 (FireWire)作為標準支持。然而,將來仍然能夠在任何商用PC上運行USB 3.0相機,而無需附加接口硬件。

  這一快速接口是實時兼容的。此外,USB 3.0接口的技術實現可將圖像數據直接傳輸到主存儲器,從而節省處理器資源;釋放出的處理器產能可用于圖像處理應用。這反過來可實現更復雜的處理步驟,并將結果更快地演示給用戶。

  如果需要長線材,就是更具優勢的千兆網(GigE)接口的舞臺。

  6. 總結

  要為您的特定應用選擇顯微相機,可入選的產品范圍很廣。這一范圍包括了使用不同的感光芯片技術、芯片尺寸、分辨率和幀速率的彩色和黑白相機型號。

  未來,得益于性能的進一步發展和顯著改善,帶CMOS芯片的相機將在顯微鏡應用中發揮重要作用。CMOS芯片不僅具有成本效益、尺寸緊湊、用途廣泛,同時還提供半導體芯片不會發生光暈或拖影效應的優勢。此外,較新的CMOS芯片可降低噪聲。預計CMOS芯片將在數字相機中的許多應用領域取代CCD芯片。

  在選擇最合適的顯微相機時,可能需要考慮以下幾個重要方面:

  成像真實生動,實現樣本的平滑移動和方便聚焦

  最大限度地提高成像質量和顏色保真度,提供良好的對比度范圍,以進行記錄、圖像處理和分析

  為光線水平弱的應用提供極好的靈敏度

  應用特點決定了潛在的具體芯片類型,例如:CCD、CMOS、NIR(近紅外)優化版本

  視場最佳重現所需的像素尺寸和分辨率影響所需的芯片尺寸

  取決于原來的系統和意向的通用性,還要考慮大小,重量,用戶舒適度,對DirectShow、TWAIN、USB3 Vision、GenICam等軟件標準的遵從

  相機選擇貼士:

  更多相機選擇,請登錄核成科技公司網站。

  彩色相機可普遍使用。如果希望使用彩色相機,請確保相機提供顏色配置。

  對于復雜的熒光應用,請考慮產生噪聲較少的黑白相機。

  如果希望在低放大倍數下重現樣品的大部分,例如要將圖像用于記錄和存檔目的,請選擇高分辨率。

  選擇合適的相機顯微鏡適配器,以便實現對視場的最佳利用。

  如果您的主要目標是在屏幕上查看樣本,那么實時圖像的成像質量和相機的速度就尤為重要。

  對于標準的顯微鏡應用,低幀速率的CCD相機一般足夠了。

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